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Introducción:
Streptococcus mutans participa en el origen y progreso de la caries dental, una de las enfermedades más prevalentes a nivel mundial. Su control requiere métodos seguros y accesibles para la población. Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh (Myrtaceae) (camu camu) es un árbol nativo de la amazonÃa peruana. La capacidad antimicrobiana de los componentes de su fruto ya se ha comprobado.
Objetivo:
Evaluar la actividad antibacteriana in vitro del extracto hidroetanólico de M. dubia contra S. mutans ATCC 35658.
Métodos:
Investigación experimental con posprueba y grupos controles. El extracto de la pulpa del fruto de M. dubia se obtuvo mediante maceración hidroetanólica. Las concentraciones evaluadas fueron 25 mg/mL, 50 mg/mL y 75 mg/mL. La capacidad antibacteriana se determinó mediante el método de difusión en disco. Gluconato de clorhexidina 0,12 % fue el control positivo y el dimetilsulfóxido al 1 % el control negativo.
Resultados:
La actividad antibacteriana se incrementó de manera directamente proporcional a la concentración del extracto. La concentración de 75 mg/mL mostró una media de inhibición de 18,2 ± 0,774 mm, seguido de la concentración de 50 mg/mL con una media de inhibición de 14,6 ± 1,055 mm y la concentración de 25 mg/mL con un halo de inhibición promedio de 10,1± 0,833 mm. La zona de inhibición del control positivo fue de 16,5 ± 0,516 mm. Existe diferencia estadÃsticamente significativa entre la concentración de 75 mg/mL y el control positivo (p< 0,05).
Conclusiones:
El extracto hidroetanólico de M. dubia muestra actividad antibacteriana in vitro de tipo bactericida sobre S. mutans ATCC 35668.
Introduction:
Streptococcus mutans is involved in the genesis and progress of dental caries, one of the most prevalent diseases worldwide, whose control requires safe methods accessible to the population. Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh (Myrtaceae) (camu camu) is a tree native to the Peruvian Amazon. The antimicrobial capacity of the components of its fruit has already been verified.
Objective:
Evaluate the in vitro antibacterial activity of M. dubia hydroethanolic extract against S. mutans ATCC 35658.
Methods:
An experimental study was conducted with post-test analysis and control groups. The extract from the pulp of the fruit of M. dubia was obtained by hydroethanolic maceration. The concentrations evaluated were 25 mg/mL, 50 mg/mL and 75 mg/mL. Antibacterial capacity was determined by the disc diffusion method. The positive control was 0.12% chlorhexidine gluconate, whereas the negative control was 1% dimethyl sulfoxide.
Results:
The antibacterial activity increased directly proportional to the concentration of the extract. The concentration of 75 mg/mL showed a mean inhibition of 18.2 ± 0.774 mm, followed by the concentration of 50 mg/mL with a mean inhibition of 14.6 ± 1.055 mm and the concentration of 25 mg/mL with an average inhibition halo of 10.1 ± 0.833 mm. The zone of inhibition of the positive control was 16.5 ± 0.516 mm. There is a statistically significant difference between the concentration of 75 mg / mL and the positive control (p< 0.05).
Conclusions:
The M. dubia hydroethanolic extract displays in vitro antibacterial bactericidal activity against S. mutans ATCC 35668.
- antibacterianos;
- extractos vegetales;
- Streptococcus mutans;
- Myrciaria dubia.
- antibacterials;
- plant extracts;
- Streptococcus mutans;
- Myrciaria dubia.
Introducción
Desde la perspectiva de la salud pública, las enfermedades bucodentales son una de las más prevalentes en todo el mundo, con amplios efectos sociales y económicos. Según Global Burden of Disease Study 2017, la caries dental constituye el trastorno de salud más frecuente.1 Desde 1960 diversos estudios han descrito ha Streptococcus mutans como un importante agente causal de la caries dental.2 Es una bacteria transmitida de padres a hijos a través de la saliva. Está presente en proporciones menores en superficies dentales sanas. Pero se incrementa cuando las condiciones son favorables.3 Su potencial cariogénico radica en su capacidad de sintetizar grandes cantidades de polÃmeros extracelulares a partir de la sacarosa, su capacidad acidogénica y acidúrica, que le permite metabolizar gran cantidad de carbohidratos a ácidos orgánicos y persistir en un ambiente ácido. Su tolerancia al oxÃgeno y producción de mutacinas para inhibir a otros estreptococos y convertirse en la especie predominante en la cavidad bucal.4
Aun cuando se sabe que S. mutans no es el único responsable del desarrollo de la caries dental, también se ha comprobado fehacientemente que su comportamiento puede alterar los microambientes bucales formando un medio rico en polisacáridos extracelulares y de pH bajo; condiciones favorables y necesarias para el progreso de otras especies acidogénicas y acidúricas. (5 Por ello su reducción en la cavidad bucal sigue siendo un objetivo principal de la investigación dirigida a reducir o eliminar la enfermedad.
La medicina tradicional y complementaria es una parte importante y con frecuencia subestimada de los sistemas de salud. Es utilizada en diversos paÃses del mundo para mantener la salud, prevenir y tratar enfermedades, y su demanda va en aumento. Para millones de personas, la fitoterapia representa la principal fuente de atención sanitaria, y a veces la única. La fitoterapia de calidad, segura y con eficacia comprobada contribuye a asegurar el acceso de todas las personas a la atención de su salud, por ello la Organización Mundial de la Salud (OMS) alienta la investigación en plantas medicinales.6
Las terapias actuales utilizadas contra la caries, se caracterizan por tener efectos secundarios y generar resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, se necesita con urgencia el desarrollo de compuestos alternativos eficaces contra las bacterias cariogénicas.7) En la última década se han estudiado un mayor número de productos derivados de plantas, con actividad antibacteriana frente a distintas bacterias incluidas S. mutans.8 Las plantas medicinales son consideradas como una alternativa de solución para contrarrestar a las enfermedades infecciosas que afectan a la población debido a que contienen alcaloides, taninos, aceites esenciales y flavonoides que se caracterizan por su actividad antimicrobiana.9
Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh (camu camu) (Myrtaceae), es un arbusto frutal nativo de la amazonia peruana (Fig.).10) Su fruto es consumido por el ser humano principalmente en forma de pulpa procesada y acumula diversos fitoquÃmicos que son asociados a importantes propiedades incluidas la antibacteriana.11 Se le ha otorgado esta propiedad debido a su alto contenido de compuestos fenólicos presentes en la cáscara, pulpa y semillas del fruto.12 Existen investigaciones que demuestran la capacidad antimicrobiana de M. dubia. Se ha informado dicho efecto en extractos a partir de la cáscara y semillas sobre bacterias grampositivas preferentemente.13,14) Aún no se han publicado estudios en los que se haya evaluado el extracto hidroetanólico de la pulpa del fruto sobre microorganismos de interés estomatológico.
Los antecedentes consultados afirman la presencia de compuestos bioactivos en diversas partes del fruto de M. dubia con actividad antimicrobiana. Al ser una planta autóctona del Perú es importante contribuir con evidencia cientÃfica que sustente su potencial farmacológico sobre S. mutans. Esperamos que futuras investigaciones puedan incorporar los compuestos antibacterianos del fruto de esta planta en productos orales como colutorios o pastas dentales y de esta manera constituyan alternativas de solución para contrarrestar los efectos de la caries dental en la población. En ese sentido, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la actividad antibacteriana in vitro del extracto hidroetanólico de M. dubia contra S. mutans ATCC 35658.
Métodos
Material vegetal de Myrciaria dubia y obtención del extracto hidroetanólico
Se realizó una investigación experimental con diseño de estÃmulo creciente con posprueba únicamente y grupos controles. Los frutos de M. dubia fueron proporcionados por la Empresa Agroindustrial del Perú S.A. Lima, Perú (Lat. -12.103346, Long. -77.019467) durante febrero de 2019. El espécimen fue identificado en el Herbarium Truxillense (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo (Trujillo, Perú) como: familia: Myrtaceae; nombre cientÃfico Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh y registrada con el código No 59433. Las muestras fueron transportadas en un cooler refrigerado (5 ºC) hasta el laboratorio de investigación de la Universidad Señor de Sipán en Chiclayo, Perú. En el laboratorio, el fruto fue lavado con agua corriente y desinfectado en su superficie con torundas de algodón con alcohol al 70 %. En condiciones asépticas se le retiró la piel y semillas. La pulpa fue triturada en mortero con pilón y colocada en un vaso de precipitados estéril cubierto en su superficie con papel de aluminio en una cantidad 250 g. Se incorporó la mezcla hidroetanólica al 80 % y se maceró durante 72 h en agitación con sonicador Fisherbrandâ„¢ modelo Q500 con sonda (Madrid, España). Luego el macerado fue centrifugado en una centrÃfuga Thermo Scientific modelo Sorvall ST 8R (Massachusetts, EE UU) durante 5 min a 5 635 x g y decantado en un recipiente estéril. Se filtró dos veces con papel de filtro Whatman No 1 y No 2. El filtrado final se llevó a sequedad forzada en rotavapor marca BOUCHI modelo R215 a 50 ºC durante 2 h, obteniéndose el extracto seco. A partir del extracto seco crudo se prepararon tres concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL y 75 mg/mL usando como solvente dimetilsulfóxido (DMSO) (Thermo Scientificâ„¢ 85190) al 1 %. Las concentraciones fueron colocadas en viales estériles de color ámbar, tapados herméticamente, y preservadas en refrigeración (5 ºC) hasta su utilización.15
Estandarización del inóculo de Streptococcus mutans ATCC 35658
Se utilizó una cepa de S. mutans ATCC 35658, adquirida de la empresa Gen Lab del Perú S.A.C. (Lima, Perú). Fue reactiva en caldo Mueller Hinton (Merck Peruana SA) 20 h antes de la evaluación antibacteriana. El inóculo fue estandarizado espectrofotométricamente a partir del caldo de reactivación a una concentración aproximada de 1,5 x108 UFC/mL, con una absorbancia de 0,09 a una longitud de onda de 625 nm.
Preparación de medios de cultivo y discos de difusión
El medio de cultivo utilizado fue agar base sangre (Merck Peruana SA) suplementado con 5 % de sangre de carnero desfibrinada. Fue preparado y servido en placas de vidrio de 100 mm el mismo dÃa de la experimentación al igual que los discos de difusión, preparados a partir de papel filtro Whatman con un diámetro de 6 mm y esterilizados en estufa marca Memmert modelo SN-55 (Alemania). Se impregnaron con las concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL y 75 mg/mL del extracto hidroetanólico del fruto de M. dubia y con las de los controles. El control positivo fue gluconato de clorhexidina al 0,12 % y el control negativo DMSO al 1 %. Los discos preparados se secaron en una cabina de bioseguridad Clase II, marca Angelantoni, modelo Bioban 48 (Italia) a temperatura ambiente e inmediatamente utilizados en los ensayos.
Actividad antibacteriana mediante el método de difusión en disco
A partir del inóculo estandarizado y con ayuda de un hisopo estéril se realizó la siembra en la superficie de las placas servidas. La siembra se realizó en tres direcciones opuestas y en los bordes para asegurar una distribución uniforme del inóculo. Después de la siembra se colocaron los discos con las sustancias a evaluar y las placas de Petri se dejaron reposar durante 30 min a temperatura ambiente, y luego llevadas a incubación a 35 °C ± 2 °C en atmósfera con 5 % CO2 durante 24 h.15,16,17
Lectura de resultados
Se evaluaron 15 replicaciones por cada uno de los tratamientos. La actividad antibacteriana se evaluó por el método de difusión en disco. Para ello se analizaron todas las placas de Petri sembradas en busca de zonas de inhibición alrededor de los discos de sensibilidad, tanto en las concentraciones del extracto evaluado como de los controles. Las zonas de inhibición fueron medidas con un vernier mecánico marca Mitutoyo® (Japón) e informadas como promedio de halos de inhibición en milÃmetro (mm) según tratamiento y desviación estándar.16
Análisis estadÃstico
Se realizó con el software spss v. 24. Se aplicó estadÃstica descriptiva y se compararon los datos de las zonas de inhibición mediante la prueba de Kruskal-Wallis. El nivel de significación estadÃstica se estableció en p< 0,05.
Resultados
Se determinó la actividad antibacteriana mediante el método de difusión en disco de las concentraciones de 25 mg/mL, 50 mg/mL y 75 mg/mL del extracto hidroetanólico de la pulpa del fruto de M. dubia y se compararon con el efecto del control positivo gluconato de clorhexidina al 0,12 % y DMSO al 1 % como control negativo.
En la tabla se observa la comparación de las medias de halos de inhibición formados en los grupos problema y grupos controles. Se encontró que la concentración de 75 mg/mL formó un halo de inhibición promedio de 18,2 ± 0,774 mm, superando al control positivo gluconato de clorhexidina que formó un halo de inhibición promedio de 16,5 ± 0,516 mm. El control negativo (discos con DMSO 1 %) no formó halo de inhibición. Existe diferencia estadÃsticamente significativa debido a que la concentración de 75 mg/mL del extracto de M. dubia tuvo mayor efecto antibacteriano que el control positivo (p< 0,05).
Discusión
La caries dental no tratada en dientes permanentes es la enfermedad humana mas pevalente a nivel mundial y la décima en dentición decidua. Además es la principal causa de edentulismo en adultos. S. mutans es una especie bacteriana considerada clave en el proceso de caries. Pero ahora se sabe que no actúa sola y, por el contrario, forma parte de una comunidad bacteriana compleja.17 Sin embargo, investigaciones precendentes manifiestan el potencial antibacteriano de las plantas medicinales en la regulación de los principales patógenos orales.
M. dubia comúnmene denominada camu camu, es un árbol que crece en la selva alta de la amazonÃa del Perú. Su fruto ha atraÃdo la atención porque contiene grandes cantidades de vitamina C, y diversos constituyentes dentro de los que se encuentran los carotenoides, antocianinas y diversos compuestos fenólicos.18) En ese sentido, Kaneshima y otros19 y Conceição y otros12 investigaron los componentes y el potencial antimicrobiano de la piel y semillas del extracto extanólico M. dubia sobre bacterias grampostivas incluida una cepa de S. aureus meticilino resistente, bacterias gramnegativas y levaduras, respectivamente.
Kaneshima y otros19 informaron que los extractos de n-hexano de la cáscara y semillas de camu-camu exhibieron fuertes actividades antimicrobianas contra bacterias grampositivas, pero ninguna actividad contra bacterias gramnegativas y hongos. El compuesto antibacteriano detectado mayormente fue rodomrtona y el acilfloroglucinol que afectan la expresión de proteÃnas celulares, la biosÃntesis de la pared celular y la división celular. Por su parte, Conceição y otros12 establecieron que en general, los extractos de camu-camu fueron más activos contra bacterias grampositivas que contra bacterias gramnegativas, semejante a los informado por Kaneshima y otros,19 sin embargo, ellos relacionan el efecto antibacteriano del extracto con derivados del ácido elágico y miricetina.
Esos resultados se relacionan con los obtenidos en la presente investigación pues se informó fuerte actividad antibacteriana, principalmente en las concentraciones de 50 mg/mL y 75 mg/mL del extracto hidroetanólico de la pulpa de la fruta de M. dubia con halos de inhibición de 14,6 mm y 18,2 mm, respectivamente. Resultados que sugieren que probablemente la rodomrtona sea responsable de la actividad antibacteriana, pues además de estar presente en la cáscara y las semillas también se encuentra en la pulpa.
Asimismo, Camere-Colarossi y otros20 evaluaron la actividad antibacteriana del extracto metanólico de la semillas y la pulpa de M. dubiay un control clorhexidina 0,12 % contraS. mutansyS. sanguinis. Comunicaron que el extracto de semillas tuvo un efecto antibacteriano estadÃsticamente significativo en comparación con el extracto de pulpa contra S. mutans. Informaron promedios de halos de inhibicion de 21,36 mm para el extracto de las semillas y de 16,2 mm para extracto de pulpa. Estos resultados se relacionan estrechamente con los informados en la presente investigación e indicarÃan que tanto el metanol como el etanol son dos compuestos apropiados para la extracción de principios activos de M. dubia. Asimismo corrobora la capacidad antibacteriana de los compuestos biactivos presentes en el extracto de la pulpa contra bacterias grampositivas. Pincipios activos que según Roumy y otros21 podrÃan ser los taninos, floroglucinol, compuestos activos apolares triterpénicos, β-sitosterol y ácido betulÃnico.
Investigaciones como las de Fujita y otros22,23 y Fidelis y otros24 comprobaron la actividad antibacteriana de los extractos crudos y liofilizados de polvos del fruto de camu camu contra S. aureus. Esto indicarÃa y confirmarÃa que los principos activos presentes en el fruto de camu camu tienen actividad antibacteriana preferentemente sobre bacterias grampositivas.
La presente investigación concluye que el extracto hidroetanólico del fruto de M. dubia presenta actividad antibacteriana in vitro de tipo bactericida sobre S. mutans ATCC 35668.
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- » Recibido: 14/08/2020
- » Aceptado: 25/09/2020
- » Publicado : 01/08/2021
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