ARTÍCULO ORIGINAL

Perfil de resistencia a insecticidas en una cepa de Aedes aegypti (Linnaeus) de la región Caribe de Costa Rica

Insecticidal resistance profiles of an Aedes aegypti (Linnaeus) strain from the Caribbean Region of Costa Rica

MSc. Ólger Calderón-Arguedas,^I Dr.C. Adriana Troyo^II

^I Departamento de Parasitología, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica (UCR).
^II Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET). Costa Rica.

RESUMEN

Introducción: el dengue constituye la principal enfermedad de transmisión vectorial en Costa Rica. El control del vector Aedes aegypti consiste en la aplicación de piretrinas y temefós, por lo cual es importante monitorear la aparición de resistencia a estos insecticidas.
Materiales y métodos: se efectuaron bioensayos con larvas de Ae. aegypti procedentes del cantón de Guácimo en la Región Caribe de Costa Rica. Grupos de 20 larvas fueron expuestos por 24 horas a concentraciones de insecticidas que provocaran una mortalidad entre el 2 y el 100 %. Las pruebas fueron efectuadas por quintuplicado y se calculó la concentración letal 50 % (CL₅₀). Como control susceptible se empleó la cepa Rockefeller. Un radio de resistencia 50 % (RR₅₀) fue calculado para cada insecticida. En caso de resistencia se repitieron los ensayos exponiendo las larvas a butóxido de piperonilo (PB) y S, S, S, tributilfosforotritioato (DEF) para perfilar el mecanismo enzimático vinculado con dicha resistencia.
Resultados: no se observó resistencia a temefós y deltametrina, pero sí se encontró resistencia incipiente a la cipermetrina (CL₅₀ = 0,00845 mg/L, rango: 0,00664-0,01038, RR₅₀ = 6,07). El análisis con sinergistas determinó un radio de singergismo (RS) de 19,2 para el PB y de 0,9 para DEF.
Discusión: los resultados demuestran que existe un proceso de desarrollo de resistencia a la cipermetrina en los mosquitos Ae. aegypti en esta localidad, el cual está relacionada con la actividad citocromo P450 monooxigenasa. Esto alerta a las autoridades para sustituir dicho insecticida y así asegurar el adecuado control del vector sin la generación de resistencia.

ABSTRACT

Introduction: dengue is the main vector-borne disease in Costa Rica. The control of the vector Aedes aegypti covers the application of pyrethrins and temephos. For this reason, it is important to monitor the development of resistance to these insecticides.
Material and Methods: bioassays were performed using Ae .aegypti larvae from the county of Guacimo in the Caribbean region of Costa Rica. Twenty-larvae groups were exposed to insecticidadl concentrations for 24 hours, which would generate 2 to 100 % mortality. The tests were performed five times, and a 50 % lethal concentration (LC50) was calculated. The Rockefeller strain was used as susceptibility control. A 50 % resistance ratio (RR50) was calculated for each insecticide. When resistance occurred, tests were repeated by exposing the larvae to piperonyl butoxide (PB) and S, S, S, tributylphosphorotrithioate (DEF) in order to determine the enzymatic mechanism associated with this resistance.
Results: no resistance to temephos or deltamethrin was observed, but emerging resistance to cypermethrin was detected (LC50 = 0.00845 mg/L, range from 0.00664 to 0.01038, RR50 = 6.07). The synergistic analysis determined a synergism ratio (SR) of 19.2 for PB and 0.9 for DEF.
Conclusions: these results show that there is a process of developing resistance to cypermethrin in Ae. aegypti mosquitoes of this county, which is associated with cytochrome P450 monooxygenase activity. This alerts authorities to the need of replacing this insecticide and ensure the appropriate vector control without generating resistance.

Key words: dengue, Aedes aegypti, arbovirus, vector borne diseases, Costa Rica.

INTRODUCCIÓN

A nivel mundial, el dengue constituye la principal enfermedad de transmisión vectorial en términos de incidencia; se estima que existen alrededor de 2,5 billones de personas en riesgo de infección con un reporte de casos que va desde los 50 a 100 millones por año.¹ En Costa Rica el dengue hizo su aparición en 1993 en las ciudades de Puntarenas y Liberia de donde se extendió rápidamente a otras zonas geográficas del país.² Desde el año de su aparición hasta el final del 2013 se han contabilizado 313 245 casos de dengue y dengue grave, con 23 muertes. Las regiones más afectadas actualmente están localizadas en el centro y norte de la costa pacífica y en la costa Caribe.³

El principal vector, Aedes aegypti, fue erradicado del país al inicio de la década de los años sesentas, pero posteriormente se dieron infestaciones puntuales y recurrentes en las décadas de los setentas y de los ochentas.⁴ Para 1993 se admitió, por parte del Ministerio de Salud, la distribución del vector por la mayor parte de la geografía nacional, hecho que presidió la ocurrencia de los primeros casos de la virosis al finalizar ese año.⁵

Dada la ausencia de una vacuna y de tratamiento antiviral, la principal alternativa de control del dengue se centra en el control de las poblaciones del vector. A pesar de que la participación comunitaria y el saneamiento ambiental son claves en lo que respecta a disminuir los sitios de oviposición y desarrollo larval de Ae. aegypti, dichos aspectos por sí solos no han sido suficientes para disminuir las poblaciones del vector a un nivel en que no se produzcan eventos epidémicos.⁶ Por tal razón, el control químico sigue siendo una herramienta fundamental en las acciones de control vectorial contra el Ae. aegypti. En este sentido, a lo largo de la última década, en Costa Rica se han empleado piretrinas como la deltametrina y la cipermetrina en el control adulticida de Ae. aegypti, mientras que el organofosforado temefós ha sido el principal insecticida empleado en el control larval del vector.

Los estudios sobre resistencia a insecticidas que se han efectuado con cepas de Ae. aegypti de Costa Rica son escasos y fragmentarios. Estos han sido colaboraciones puntuales cuyo marco experimental ha sido desarrollado en otros países.^4,7 Por esta razón no se tiene una noción actualizada de la situación de resistencia que muestra dicho vector a los insecticidas que actualmente se utilizan para su control.

Dada la importancia del uso racional de los insecticidas, es importante evaluar las condiciones de susceptibilidad que exhiben los vectores con el fin de garantizar la efectividad de los tratamientos y evitar el riesgo de generar poblaciones resistentes. Por tal razón, el propósito del presente estudio fue evaluar las condiciones de resistencia a los principales insecticidas utilizados en el control vectorial así como los mecanismos de detoxificación que exhibe una cepa de Ae. aegypti procedente de una localidad endémica de la Región Caribe de Costa Rica.

MÉTODOS

Cepas de Ae. aegypti

Para las evaluaciones efectuadas se generó una colonia a partir de material larval colectado de 89 criaderos diferentes durante marzo del 2013 en el Cantón de Guácimo, provincia de Limón en la Región Caribe de Costa Rica (10°12'46"N; 83°41'12"O). Esta cepa se denominó Cepa Guácimo. Los bioensayos larvales se efectuaron utilizando larvas de tercera generación (F3).

Como cepa control se empleó la cepa Rockefeller, suministrada por el Instituto "Pedro Kourí" (La Habana, Cuba), la cual es una cepa establecida durante la década de los años 30s y es sensible a los insecticidas evaluados.⁴ Las larvas fueron mantenidas en bandejas con agua libre de cloro, a una temperatura de 27,8 ± 0,1 °C, una humedad relativa del 95 % y un fotoperiodo de 12 h. Los mosquitos adultos se confinaron a jaulas entomológicas de 30 x 30 x 30 cm con un suministro de sacarosa al 10 % y un recipiente con agua libre de cloro como sitio de ovipostura. Las larvas obtenidas a partir de estos huevos constituyeron la siguiente generación larval.

Insecticidas y sinergistas

Temefós: Fosforotritionato de o, o, o, o'-tetrametil-o, o'-tio-di-p-fenileno (IUPAC). Chem Service. West Chester Pennsylvania. Grado Analítico. 97,6 % de pureza.

Deltametrina: [(1R,3R)-3-(2,2-dibromovinil)- 2,2-dimetilciclopropano carboxilato de (S)-alfa-ciano-3-fenoxibenzilo (IUPAC). Chem Service West Chester Pennsylvania. Grado Analítico. 99,5 % de pureza.

Cipermetrina: (1RS)-cis,trans-3-(2,2-diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropano carboxilato de (RS)-ciano-3-Fenoxibencilo (IUPAC). Grado técnico. Suministrado por Fmc Corporation. 95 % de pureza.

S,S,S, tributilfosforotritioato (DEF). Chem Service. West Chester Pennsylvania. Grado Analítico. 97,5 % de pureza.

Butóxido de Piperonilo (PB). Chem Service. West Chester Pennsylvania. Grado Analítico. 98,2 % de pureza.

Bioensayos larvales

Los bioensayos larvales se efectuaron de acuerdo a metodologías descritas previamente.⁸ Brevemente, se trabajaron larvas de tercero y cuarto estadio provenientes de una colonia establecida con material colectado en la localidad de Guácimo. Se evaluaron por quintuplicado cinco concentraciones de los insecticidas, las cuales generaron entre un 2 y un 100 % de mortalidad en larvas de tercero y cuarto estadio. Para cada réplica se utilizaron 20 larvas. Los insecticidas fueron diluidos en alcohol absoluto y 1,0 mL de cada solución madre fue disuelto en 249,0 mL de agua libre de cloro para alcanzar la concentración de trabajo donde fueron colocadas las larvas. Los controles de viabilidad se montaron utilizando 1,0 mL de alcohol absoluto en lugar del insecticida. Los experimentos fueron efectuados en condiciones controladas a 27,8 ± 0,1 °C, 95 % de humedad relativa y un fotoperíodo de 12 horas. La mortalidad se registró a las 24 horas, contemplando para este fin la cuantificación de larvas muertas o moribundas. Posteriormente se efectuó un análisis probit-log, con el que se calculó la concentración letal 50 % (CL₅₀)_. El valor de significancia utilizado como factor de heterogeneidad fue de 0,05. Para la ejecución de dicho análisis se empleó el programa SPSS v.11.5 para WindowsÒ. La cepa control de susceptibilidad (Cepa Rockefeller) se procesó de la misma forma que la cepa generada con el material colectado en el campo. Para cada insecticida se calculó un radio de resistencia 50 % (RR₅₀) relacionando el valor de la CL₅₀ de la cepa Guácimo con la CL₅₀ de la Cepa Rockefeller. En los casos en que el RR₅₀ fue mayor a 5; condición que denota una condición de resistencia y con el fin de perfilar el mecanismo de detoxificación correspondiente, se realizó una réplica de los ensayos exponiendo las larvas a concentraciones subletales de los sinergistas por un período de 4 horas previo a su exposición a los insecticidas. Las concentraciones empleadas fueron 5 mg/L para el PB, el cual es un inhibidor de la actividad Citrocromo P450 monoxigenasa, y 0,008 mg/L para el DEF, cuyo efecto es inhibitorio sobre actividades esterasa.⁹ Posteriormente se calculó un radio de sinergismo (RS) relacionando para cada insecticida la CL₅₀ obtenida en el ensayo inicial con la CL₅₀ calculada en larvas expuestas al sinergista.

RESULTADOS

Con respecto a la condición de resistencia al temefós, la CL₅₀ que se determinó para la Cepa Guácimo fue 0,01196 mg/L, en tanto que para la cepa Rockefeller, ésta fue de 0,005 mg/L (tabla 1). El RR₅₀ correspondiente fue de 2,30 (tabla 1). En relación con la deltametrina, la CL₅₀ para la cepa Guácimo fue de 0,00224 mg/L, mientras que para la cepa Rockefeller fue de 0,00156. El RR₅₀ de la cepa Guácimo sobre la Rockefeller fue de 1,43 (tabla 1). En el caso de la cipermetrina, la cepa Guácimo mostró un valor de CL₅₀ de 0,00845 mg/L, mientras que para la cepa Rockefeller la CL₅₀ fue 0,00139 mg/L. En este caso el RR ₅₀ tuvo un valor de 6,07 (tabla 1). Dado que este valor es superior a 5,00, se procedió a realizar la evaluación del efecto de los sinergistas sobre la condición de resistencia de la Cepa Guácimo a la cipermetrina. En relación con este aspecto, la utilización de PB permitió calcular un RS de 19,2 cuando se dio la exposición previa de la Cepa Guácimo a este sinergista. La utilización de DEF permitió obtener un radio de sinergismo de 0,88 (tabla 2).

DISCUSIÓN

De acuerdo a los criterios establecidos por Mazzari y Georghiou para interpretar la resistencia en términos de RR₅₀, se asume que RR ₅₀ inferiores a 5 representan sensibilidad a insecticidas, valores superiores a 5 pero inferiores a 10 suponen una condición de resistencia incipiente y valores superiores a 10 se relacionan con una resistencia manifiesta.¹⁰

Con respecto a la Cepa Guácimo, no se pudo evidenciar resistencia al temefós en dicha cepa. A nivel de Latinoamérica la resistencia al temefós por parte de Ae. aegypti ha sido observada en varios países incluyendo Brasil,¹¹ Cuba,¹² El Salvador,¹³ Argentina,¹⁴ Bolivia,¹⁵ Venezuela,¹⁶ Perú¹⁷ y Colombia.¹⁸ En relación con Costa Rica, un estudio publicado recientemente por Bisset y colaboradores también determinó la condición de resistencia al temefós en dos cepas.⁴ Una de éstas procedió de la localidad de Cariari (Cantón Pococí, Provincia de Limón), en la región Caribe del país, la cual se encuentra en proximidad con el Cantón de Guácimo. En este caso el RR₅₀ con respecto a la Cepa Rockefeller fue de 10,83. La otra cepa fue establecida con material entomológico colectado en la Ciudad de Jacó (Provincia de Puntarenas) en la costa pacífica. En este caso el RR₅₀ fue de 19,16.⁴ La evidencia de esta condición de resistencia, así como los niveles reportados llaman la atención considerando que el uso masivo de temefós en el control focal de Ae. aegypti en la Región Caribe se implementó de forma generalizada hasta finales del 2007, siendo el material entomológico utilizado en ese estudio colectado hasta el 2010 (Marín-Rodríguez, comunicación personal). En algunos de los países donde se ha detectado resistencia de Ae. aegypti al temefós, su empleo usualmente ha tenido lugar a lo largo de décadas.^19,20 Además, algunos estudios han podido determinar que la constitución genética de las poblaciones de Ae. aegypti a lo largo de Región Caribe de Costa Rica es homogénea.²¹ Por lo tanto, la diferencia observada en este estudio en comparación con el de Bisset y colaboradores⁴ supone un proceso de selección de resistencia que podría estar dado por una deficiente aplicación del químico puntualmente en la localidad de Cariari. En este sentido, la aplicación de insecticidas en concentraciones subletales constituye una de las principales causas de selección de la resistencia a estos químicos. En un estudio de laboratorio se pudo observar que después de someter poblaciones de Ae. aegypti a concentraciones subletales de temefós fue posible evidenciar resistencia al insecticida en el 58,33 % de los individuos a partir de la novena generación, en tanto que un 95,83 % de los mismos era resistente al químico para la décimo novena generación.¹⁹

El hecho de haber encontrado susceptibilidad al temefós puede indicar que la forma en que se da la aplicación actual del insecticida es adecuada para el control larval de Ae. aegypti en localidades como Guácimo. De hecho en el mismo estudio de Bisset y colaboradores se pudo determinar que los formulados comerciales que actualmente se están aplicando son altamente efectivos. Dichos investigadores demostraron que mediante la aplicación de una concentración inicial del 1 ppm y con recambios diarios de agua se logró un 100 % de mortalidad larval hasta los días 11 y 12, lo que denota una adecuada residualidad del químico.⁴ Por esta razón, se considera que el temefós sigue siendo una herramienta primordial y efectiva en el control de Ae. aegypti en la Región Caribe de Costa Rica.

En relación con la resistencia a piretroides, éste es un fenómeno que también ha sido observado en diferentes países de Latinoamérica.^17,22 Dado que actualmente estos insecticidas son parte de los productos más utilizados en el control adulticida de Ae. aegypti en la región, las poblaciones del vector están sometidas a presiones selectivas que dictan la aparición de resistencia a esta familia de químicos. Los únicos datos sobre resistencia a piretroides en Costa Rica son los que aportan Rodríguez y colaboradores¹⁷ y Bisset y colaboradores.⁴ Rodríguez y colaboradores observaron una resistencia incipiente a la ciflutrina,¹⁷ en tanto que Bisset y colaboradores evidenciaron una alta resistencia a la deltametrina con RR₅₀ de 81,48 para la cepa de Cariari y 59,25 para la cepa de Jacó.⁴ Sin embargo la resistencia observada en esas misma cepas para la cipermetrina fue baja, con RR ₅₀ de 4,76 para la cepa de Cariari y 4,53 para la cepa de Jacó.⁴ En dicho estudio se observó que los mecanismos asociados a la condición de resistencia hacia la deltametrina estuvieron relacionados con la presencia de esterasas ya que la aplicación de DEF redujo el efecto de resistencia.⁴ En contraste, en nuestro estudio se pudo observar que la resistencia que mostró Ae. aegypti a la cipermetrina estuvo relacionada con la la detoxificación mediada por enzimas tipo citocromo P450 monooxigenasa, dada la reversión del estado de resistencia observada tras la exposición de las larvas a PB. La sobreexpresión de enzimas citocromo P450 monooxigenasa constituye, junto con las mutaciones en los genes que codifican para las proteinas que conforman los canales de sodio (mecanismo de resistencia kdr o "Knockdown" resístanse), los mecanismos más importantes que presentan los mosquitos en relación con la resistencia a piretroides y organoclorados.²³ Por lo tanto, los resultados obtenidos en la presente investigación son coherentes con lo esperable para la resistencia a este tipo de compuestos químicos. Este hallazgo debería sugerir a las autoridades de salud la posibilidad de sustituir en futuro próximo la cipermetrina por otro insecticida, con el fin de no generar una resistencia manifiesta a este producto que constituye una de las alternativas más importantes en el control adulticida de Ae. aegypti.

A manera de conclusión, es pertinente subrayar que los procesos de control químico para Ae. aegypti deben estar vinculados a continuas evaluaciones acerca de la susceptibilidad que exhibe el vector a los insecticidas empleados. Estas evaluaciones deben efectuarse de forma previa a la aplicación de nuevos productos y durante su aplicación en las campañas de control. A su vez las cepas evaluadas deben ser basadas en colonias representativas de las áreas geográficas donde se van a aplicar dichos insecticidas. Cabe además mencionar que el control químico es uno de los eslabones del control integrado, por lo que éste debe de aplicarse de forma mancomunada con otras alternativas de control.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer al Dr. Juan Bisset Lazcano del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri", La Habana, Cuba por haber suministrado la Cepa Rockefeller para los ensayos efectuados y por la retroalimentación de las ideas que se presentan en el presente documento. Al Dr. Rodrigo Marín Rodríguez, a Manuel Gutiérrez y Ezequías Maynés del Ministerio de Salud de Costa Rica por el apoyo logístico en el proceso de colecta de material entomológico. También desean extender su agradecimiento a Katherine Salazar Zeledón, Paola Sequeira, Paola Jiménez, Iván Elizondo, Iván Coronado y Adrián Avendaño del Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET) de la Universidad de Costa Rica (UCR) por su colaboración en el componente operativo de la investigación. Y a la Vicerrectoría de Investigación (UCR) por su apoyo financiero al proyecto VI-803-B2-106.

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Recibido: 26 de marzo de 2014.
Aprobado: 26 de septiembre de 2014.

MSc. Ólger Calderón-Arguedas. Oficina 208. Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica. Código Postal 2060 San José, Costa Rica. Correo electrónico: olger.calderon@ucr.ac.cr. Tel. (506):2511-8628