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Actividad tripanocida de Piper solmsianum C. DC. sobre formas epimastigota y tripomastigota de Trypanosoma cruzi
Trypanocidal activity of Piper solmsianum C. DC. against epimastigote and trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi
Jorge I. Jhoao Mejía-Parra,I Michel A. Pérez-Araujo,I Judith Roldán-Rodríguez,II Consuelo Rojas-Idrogo,I Massuo J. Kato,III Guillermo E. Delgado-ParedesI
I Facultad
de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Lambayeque,
Perú.
II
Departamento de Microbiología y Parasitología, Universidad Nacional
de Trujillo. Trujillo, Perú.
III
Instituto de Química, Universidade de São Paulo. São Paulo-SP,
Brasil.
RESUMEN
Introducción:
la infección por Trypanosoma cruzi, conocida como enfermedad de
Chagas, es un problema importante de salud pública en países de América
Central y Sudamérica.
Objetivo: evaluar la actividad de extractos crudos de acetato de etilo
de plantas in vitro de 6-8 meses y 10-12 meses de edad, de tallos leñosos
y hojas de plantas silvestres maduras y el lignano tetrahidrofurano grandisina,
aislados de Piper solmsianum, sobre las formas epimastigota y tripomastigota
de T. cruzi in vitro.
Métodos: en la evaluación del efecto de diversos extractos
crudos de acetato de etilo y grandisina de P. solmsianum, sobre la viabilidad
de las formas epimastigota y tripomastigota de T. cruzi, se utilizó
el método MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromuro).
Resultados: en la forma epimastigota, el mejor resultado en la inhibición
del crecimiento fue obtenido con 50 µg/mL de extracto de tallo y en la
forma tripomastigota con 25 y 50 µg/mL de grandisina y plantas in vitro
de 6-8 meses de edad, respectivamente. En todos los casos los valores de inhibición
oscilaron entre 86 a 96 %. Plantas in vitro de 6-8 meses de edad y grandisina
fueron más activas sobre las formas epimastigota y tripomastigota de T.
cruzi con valores de CI50 de 0,018 y 0,360 µg/mL, respectivamente.
Conclusiones:
se demuestra la actividad tripanocida de extractos de plantas silvestres y plantas
in vitro de P. solmsianum.
Palabras clave: actividad tripanocida; extracto de plantas; grandisina; Piperaceae; plantas in vitro.
ABSTRACT
Introduction:
the infection by Trypanosoma cruzi, known as Chagas' disease, poses a
major public health problem in Central and South America countries.
Objective: to evaluate the activity of crude ethyl acetate extracts from
in vitro plants of 6-8 and 10-12 months of age, stem barks and mature
wild plant leaves and tetrahydrofuran lignin grandisin isolated from Piper
solmsianum against the epimastigote and trypomastigote forms of T. cruzi
in vitro.
Methods: in the evaluation of the effect of various crude ethyl acetate
extracts and grandisin from P. solmsianum on the viability of epimastigote
and trypomastigote forms of T. cruzi, the MTT method (3-(4,5-dimethylthiazol-2-il)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide) was used.
Results: in the epimastigote form, the best results in growth inhibition
was obtained with 50 µg/mL of stem extract, and in the trypomastigote form,
with 25 and 50 µg/mL of grandisin and 6-8 months-old in vitro plants,
respectively. The inhibition values in all cases ranged from 86 to 96 %. 6-8
months old in vitro plants and grandisin were found to be active against
the epimastigote and trypomastigote forms of T. cruzi with IC50
of 0.018 µg/mL and 0.360 µg/mL, respectively.
Conclusions:
the trypanocidal activity of extracts from wild plants and in vitro plants
of P. solmsianum was proved.
Keywords: trypanocidal activity; plant extract; grandisin; Piperaceae; in vitro plants.
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es, después de la malaria, el mayor problema endémico de salud pública en varios países de América del Sur y Central, con 18-20 millones de infectados, lo que representa un riesgo para 25 millones de personas, desde el sur de los Estados Unidos hasta el sur de la Argentina, con 200 000 nuevos casos anuales y 21 000 muertes por año.1-3 La enfermedad de Chagas está asociada a las condiciones de pobreza de áreas rurales en América del Sur y Central y es causada por Trypanosoma cruzi Chagas, parásito transmitido al humano por los vectores Triatoma infestans, T. dimidiata, T. nitida, Pastrongylus megistus, Rhodnius prolixus y otros. Algunas personas infectadas con el parásito viven toda su vida sin mostrar signos de la enfermedad, pero otras infectadas muestran severos síntomas que en muchos casos resultan fatales.4 En general, la infección con T. cruzi es una seria amenaza para la vida y en su fase aguda y/o crónica acarrea severas complicaciones cardiacas.5
Durante su complejo ciclo de vida T. cruzi tiene tres principales estadios de desarrollo en diferentes hospederos. La forma replicativa epimastigota ocurre en el intestino del insecto vector, y las formas amastigota después que son liberados en el flujo sanguíneo como tripomastigota, en los mamíferos hospederos, pueden infectar otras células o ser ingeridos por el insecto vector. En el intestino del triatomino, los tripomastigota se diferencian en otras formas reproductivas, epimastigota, los que en la ampolla rectal se transforman en los infectivos tripomastigota metacíclicos que son descargados con las heces del insecto hasta alcanzar el flujo sanguíneo de los vertebrados hospederos.5-8 Los mamíferos constituyen reservorios naturales y tenemos entre estos a armadillos, marsupiales, roedores, murciélagos y primates silvestres, así como ciertos animales domésticos como perros, gatos e incluso ratas y cobayos.9
Las drogas más comunes utilizadas en el tratamiento de la enfermedad son nifurtimox (3-methyl-4(5-nitrofurfurylideneamino)-tetrahydro-[1,4]thiazine-1,1-dioxide) y benznidazol (N-benzyl-2-nitro-1-imidazoleacetamide), ambas desarrolladas hace más de cuatro décadas; sin embargo, varios autores han coincidido en señalar que la quimioterapia corrientemente recomendada en el tratamiento y prevención de la enfermedad de Chagas tiene serias limitaciones debido a su limitada efectividad y sus efectos secundarios,10 en dependencia del área geográfica y la ocurrencia de resistencia natural así como a la baja actividad antiprotozoaria sobre el último estadio crónico.11 Nifurtimox a menudo causa anorexia, disturbios gastrointestinales, neuropatías y sarpullido, y en ambas drogas se ha observado toxicidad cardiaca y renal, lo cual contituye un fracaso en la cura de la mayoría de pacientes cuando la enfermedad es crónica, de allí que muy pocos pacientes se someten al tratamiento a largo plazo y la mayoría lo abandonan.5,12,13 Por todas estas razones resulta prioritaria la búsqueda de nuevos agentes quiomiopreventivos o quimioterapéuticos,14 sintéticos o naturales; no obstante, el conocimiento cada vez mayor que se tiene sobre la bioquímica de T. cruzi ha conducido al desarrollo de nuevos fármacos como alopurinol, purinas análogas, itraconazol, entre otros, y al conocimiento de su modo de acción,15-17 pues el desarrollo de una vacuna no es una perspectiva cercana.
Los productos naturales de origen vegetal, con actividad tripanocida potencial, son considerados alternativas válidas sobre las drogas sintéticas convencionales en el control del parásito en sus diferentes estadios de vida. Al respecto, los estudios sobre la actividad tripanocida de especies de Piperaceae son escasos si consideramos que la familia cuenta con 14 géneros y alrededor de 4 000 especies a nivel mundial,18 en que diversos compuestos bioactivos aislados en las especies de Piper y Peperomia, como amidas, alcaloides, lignanos, ácido benzoico y cromenos,19,20 han mostrado actividad tripanocida.20-32
Así tenemos, como ejemplos relevantes, que el extracto hidroalcohólico etanol:agua (90:10) de hoja de Piper regnellii, colectada en el estado brasileño de Paraná, alcanzó una alta inhibición en el crecimiento de la forma epimastigota de T. cruzi.23 Asimismo, se evaluó la actividad tripanocida de 24 extractos y fracciones de Piper arboreum y Piper tuberculatum, a través del ensayo colorimétrico MTT, sobre las formas epimastigota de la cepa Y de T. cruzi; se observó que las actividades más potentes correspondieron a las fracciones hexánicas de hojas de P. arboreum y P. tuberculatum, al igual que las fracciones hexánicas de frutos de P. tuberculatum y P. arboreum.26
Por otro lado, en extracto metanólico de hojas de Piper malacophyllum, colectado en el estado de São Paulo, se aisló el alquenilfenol gibbilimbol B el cual fue evaluado en su actividad leishmanicida contra las formas promastigota y amastigota de Leishmania infantum chagasi, así como actividad tripanocida contra la forma tripomastigota de T. cruzi,20 y más recientemente, se han reportado compuestos aislados de productos naturales, como es el caso de las amidas piperovatina y piperlonguminina, aisladas de Piper ovatum, que resultaron activos sobre las formas epimastigota y amastigota intracelular de T. cruzi.32
En otro estudio también se analizó la actividad tripanocida in vivo de sustancias aisladas de especies de Piper como, por ejemplo, la evaluación de las propiedades terapéuticas in vivo de (-)-cubebina, un compuesto aislado de semillas secas de P. cubeba y (-)-hinokinina, preparado por oxidación de (-)-cubebina.33
El objetivo del estudio fue evaluar la actividad tripanocida de extractos crudos de plantas in vitro, hojas y tallos de plantas silvestres maduras y la sustancia pura grandisina, obtenidos de P. solmsianum C. DC. sobre las formas epimastigota y tripomastigota de T. cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas.
MÉTODOS
MATERIAL BIOLÓGICO
El material biológico estuvo constituido por espigas maduras (con frutos y semillas), tallos y hojas de plantas silvestres de P. solmsianum C. DC., colectado en el Núcleo de Picinguaba, ciudad de Ubatuba, estado de São Paulo, Brasil, así como plantas in vitro crecidas en condiciones asépticas, que comprendió dos grupos de edades, plantas jóvenes de 6 a 8 meses y plantas adultas de 10 a 12 meses. Adicionalmente, se contó con el compuesto puro (-) grandisina, un lignano tetrahidrofurano (Fig. 1), purificado en el Instituto de Química de la Universidade de São Paulo (IQ/USP), a partir de espigas maduras. Las plantas fueron identificadas por el doctor Guillermo E. Delgado-Paredes de la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo (UNPRG), Lambayeque, quien se basó en la descripción realizada por Yuncker.34 Una muestra herborizada se depositó en el Herbario IQ/USP.
El parásitoT. cruzi, procedente del departamento de Arequipa, en el sur del Perú, fue proporcionado por el Laboratorio de Parasitología de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), Lima, y mantenido en especímenes de ratones (Mus musculus) BALB/c, en el Laboratorio de Artropología Parasitaria de la Especialidad de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo (UNT).
OBTENCIÓN Y CULTIVO DE PLANTAS IN VITRO
Las semillas de P. solmsianum se desinfestaron con etanol 70 % durante 1 min e hipoclorito de sodio (lejía comercial Clorox 5,25 % de cloro activo) durante 5 min, luego enjuagadas con agua destilada esterilizada e inoculadas, a razón de 3-5 semillas por tubo de ensayo de 18 x 150 mm, que contenía las sales minerales MS,35 las vitaminas m-inositol 100 mg/L y tiamina. HCl 1,0 mg/L, sacarosa 2 % y agar-agar 0,6 %; esta actividad se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Recursos Genéticos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UNPRG.
Después de 6 meses de cultivo, las plantas fueron micropropagadas por ápices caulinares y segmentos nodales, en medio de cultivo similar al anterior excepto que fue suplementado con ácido indol-3-acético (AIA) y ácido giberélico (AG3) 0,02 mg/L, respectivamente. El pH del medio de cultivo fue ajustado en 5,8 ± 0,1 con NaCl y HCl 0,1 N, respectivamente, y esterilizado en autoclave a 15 lbs/pulg2 de presión y 121 oC de temperatura durante 20 min. La incubación de los cultivos se realizó con 10 W . m-2 de irradiancia, 24-26 oC de temperatura y 16-8 h de fotoperiodo.
OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS DE PLANTAS SILVESTRES Y PLANTAS IN
VITRO
En las plantas silvestres, tallos leñosos y hojas se secaron al ambiente complementándose en estufa a 50 oC de temperatura durante una semana; posteriormente, la materia seca se molió para obtener un polvo fino y se sometió a extracción con acetato de etilo (AcOEt) por tres veces consecutivas durante 24 h. En las plantas in vitro, la materia seca, obtenida de individuos completos que incluyó tallos, hojas y raíces, de 6-8 (Fig. 2, A) y 10-12 meses (Fig. 2, B), se sometió a un proceso similar de extracción.
Las concentraciones del extracto crudo ensayadas resultaron de bioensayos previos; se tomaron como criterio el porcentaje de mortalidad de las formas epimastigota y tripomastigota de T. cruzi en relación con el tiempo transcurrido de exposición; se establecieron las siguientes concentraciones: 5, 25 y 50 µg/mL.
EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL EXTRACTO CRUDO DE AcOEt DE P. SOLMSIANUM
SOBRE LA VIABILIDAD DE LAS FORMAS EPIMASTIGOTA Y TRIPOMASTIGOTA DE T. CRUZI
Epimastigota
En epimastigota la siembra y aislamiento se inició a partir de sangre obtenida de dos especímenes de Mus musculus BALB/c, infectados con T. cruzi; se realizaron hemocultivos en medio de cultivo bifásico BHI suplementado con 10 % de sangre de conejo desfibrinada e incubados a 28 oC de temperatura. Estos medios de cultivo se examinaron diariamente con ayuda de un microscopio invertido.
La curva de crecimiento se determinó a partir del cultivo primario sembrándose 1 x 105 epimastigota/mL, en medio de cultivo bifásico BHI modificado, suplementado con 10 % de sangre de conejo desfibrinado e incubándose a 28 oC de temperatura; luego se realizó conteos diarios en cámara de Neubauer para la determinación de la curva de crecimiento en relación con el tiempo durante seis días.
Durante la ejecución del bioensayo, en una microplaca de poliestireno de 96 pocillos, se establecieron tres grupos experimentales (I, II y III) y dos grupos control (IV y V), cada uno por triplicado, agregándole a cada grupo 20 µL de epimastigota de T. cruzi, en fase de crecimiento logarítmico, a una concentración de 1x105 epimastiogota/mL y 80 µL de medio de cultivo BHI con gentamicina. Se prepararon concentraciones de 5,0; 25,0 y 50,0 µg/mL, las que fueron utilizadas en los ensayos, usando como disolvente dimetilsulfóxido (DMSO) 1 % y de cada concentración se aplicó 50,0 µL a los grupos I, II y III, respectivamente, al grupo IV 50,0 µL de BHI y al grupo V 50,0 µL de DMSO. La microplaca fue incubada a 28 oC de temperatura por cuatro días.
En relación con los blancos de estandarización, para determinar el porcentaje de inhibición se contó con los valores de las soluciones de referencia estableciéndose cuatro grupos a los que se incorporó 100 µL de BHI con gentamicina; luego al primer grupo se le suplementó 20 µL de BHI y a los otros grupos 50,0 µL del EC en las concentraciones de 5,0; 25,0 y 50,0 µg/mL, respectivamente, e incubaron a 28 oC de temperatura durante cuatro días.
En la determinación de la viabilidad, después de cuatro días de incubación de los grupos, se añadió a cada pocillo de la microplaca 10 µL de 2,5 mg/mL de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromuro (MTT) incubándose durante 75 min en oscuridad a 28 oC de temperatura (Mosmann, 1983);36 posteriormente, se agregó 100 µl de solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) 10 %, mantenida a temperatura ambiente y en oscuridad por 30 min. La absorbancia de las muestras fue leída a 492 nm en un lector de ELISA y no a 595 nm como usualmente se realiza, según lo disponible en el laboratorio.
Por otro lado, la concentración inhibitoria 50 % (CI50) fue determinada mediante el análisis de regresión lineal del gráfico, porcentaje de inhibición vs. logaritmo de la concentración del extracto.También se determinaron los valores de CI50 de los grupos, experimental y control, con la siguiente fórmula:
% inhibición= [1-(Am-Abm) / (Ar-Abr) x 100
donde:
Am: absorbancia de la muestra,
Abm. absorbancia del blanco de la muestra,
Ar: absorbancia de las soluciones de referencia y
Abr: absorbancia del blanco de referencia.
Tripomastigota sanguíneos
En la ejecución del ensayo, a partir de ratones previamente infectados, se obtuvo una muestra por punción cardiaca para la obtención de tripomastigota sanguíneos de T. cruzi, la que se colocó en tubos de ensayo esterilizados con heparina y se centrifugó a 2 000 r.p.m. durante 10 min. El sobrenadante se ajustó a una concentración de 1 x 105 tripomastigota sanguíneos/mL, realizándose el recuento en cámara de Neubauer.
Durante la aplicación del EC, 20 µL de tripomastiogota de T. cruzi se distribuyeron en pocillos de una microplaca, a una concentración de 1 x 105 tripomastigota/mL, y se procedió con el mismo protocolo seguido para el caso de los epimastigota. Asimismo, en la determinación de la viabilidad de los tripomastigota se siguió el protocolo desarrollado para los epimastigota.
ANÁLISIS DE DATOS
Los resultados se sometieron al análisis de varianza (ANOVA) y a la prueba de comparación de medias de Tukey con la finalidad de establecer las diferencias significativas entre los grupos experimentales y el control, para lo cual se utilizó el programa computarizado SPSS vr. 20 con 0,05 de significancia.
RESULTADOS
INHIBICIÓN DE EPIMASTIGOTA
Los ensayos de inhibición de epimastigota de T. cruzi en diferentes concentraciones (5, 25 y 50 µg/mL) de extractos crudos de AcOEt de plantas in vitro jóvenes (6-8 meses), plantas in vitro maduras (10-12 meses), de tallos leñosos y hojas de plantas silvestres y grandisina, obtenida de espigas maduras, indicaron que la menor tasa de inhibición en el crecimiento de epimastigota fue 72,87 % en 5,0 µg/mL de la sustancia pura grandisina mientras que la mayor tasa de inhibición en el crecimiento de epimastigota fue 96,09 % con 50,0 µg/mL de extracto de tallos (tabla 1). La tendencia general mostrada en la tabla 1 fue que conforme se incrementaba la concentración de los extractos de 5,0 a 50,0 µg/mL aumentaba también la tasa de inhibición en el crecimiento de epimastigota, y fue precisamente en la concentración de 50,0 µg/mL de todos los extractos ensayados, incluyendo la grandisina, en que se alcanzaron las tasas más altas de inhibición en el crecimiento de epimastigota.
El análisis de varianza (ANOVA) realizado para cada clase de extracto ensayado, indicó que la inhibición en el crecimiento de epimastigota resultó significativo, con el menor valor en la prueba de F de 18,48 para extractos de tallos y el mayor valor de 145,86 para plantas in vitro jóvenes (6-8 meses) (datos no mostrados en tabla 1). Por otro lado, la prueba de Tukey mostró que el extracto de plantas in vitro jóvenes (6-8 meses) de 25,0 y 50,0 µg/mL tuvieron un efecto estadísticamente similar, mientras que 5,0 µg/mL y el control resultaron estadísticamente iguales y diferentes a los otros tratamientos; además, los extractos de plantas in vitro maduras (10-12 meses), tallos y hojas de plantas silvestres, así como la grandisina, resultaron estadísticamente iguales y diferentes al control, mientras que los extractos de tallos y hojas de plantas silvestres resultaron estadísticamente iguales en las tres concentraciones ensayadas y diferentes respecto al control.
INHIBICIÓN DE TRIPOMASTIGOTA
Los ensayos de inhibición de tripomastigota de T. cruzi en diferentes concentraciones (5, 25 y 50 µg/mL) de extractos crudos de AcOEt de plantas in vitro y estructuras vegetales de plantas silvestres, indicaron que la menor tasa de inhibición en el crecimiento de tripomastigota fue 70,88 % en 5,0 µg/mL de extracto de hojas, mientras que la mayor tasa de inhibición en el crecimiento de tripomastigota fue 93,37 % con 50,0 µg/mL de grandisina (tabla 2).
El análisis de varianza (ANOVA), realizada para cada clase de extracto ensayado, indicó que la inhibición en el crecimiento de tripomastigota resultó significativo, con el menor valor en la prueba de F de 91,38 para extractos de plantas in vitro jóvenes (6-8 meses) y el mayor valor de 2347,28 para extractos de tallos (datos no mostrados en tabla 2). Por otro lado, la prueba de Tukey, para concentraciones del extracto de plantas in vitro jóvenes (6-8 meses) mostró que 25,0 y 50,0 µg/mL tuvieron un efecto estadísticamente similar y diferente cuando se utilizó 5,0 µg/mL, mientras que el tratamiento control fue diferente a todos; asimismo, una respuesta similar ocurrió con el extracto de plantas in vitro maduras (10-12 meses) en que la concentración de 5,0 µg/mL resultó diferente a las concentraciones de 25,0 y 50,0 µg/mL y el control diferente a todos, mientras que en el caso de los extractos de tallos y hojas de plantas silvestres, así como con grandisina, todos los tratamientos fueron estadísticamente diferentes entre sí, incluyendo al control.
EVALUACIÓN DE CI50
En la evaluación de CI50, si bien los valores mostrados salen fuera de la curva (< 5,0 µg/mL) (tabla 3), lo que indicaría que hubiera sido conveniente el ensayo de concentraciones aun más bajas, los resultados señalaron que el extracto de plantas in vitro (6-8 meses) 0,018 µg/mL inhibió el 50 % de crecimiento de epimastigota de T. cruzi, seguido de la grandisina, plantas in vitro (10-12 meses), hojas y tallos, en que se alcanzó el mayor valor con 0,254 µg/mL. A excepción del extracto de tallos, los otros extractos tuvieron un efecto similar en la actividad inhibitoria media. Referente al crecimiento de tripomastigota de T. cruzi, el valor más bajo de CI50 se alcanzó con la grandisina 0,360 µg/mL, mientras que en los otros extractos ensayados los valores de CI50 fueron superiores a 0,5 µg/mL; el valor más alto con 1,143 µg/mL correspondió al extracto de plantas in vitro (6-8 meses).
Al comparar los
resultados de la inhibición del crecimiento entre epimastigota y tripomastigota
de T. cruzi, los valores más bajos de CI50 correspondieron
a epimastigota en un rango de 0,018 a 0,254 µg/mL, mientras que los valores
más altos de CI50 correspondieron a tripomastigota en un rango
de 0,360 a 1,143 µg/mL; resultados que indicaron que la forma tripomastigota
fue más resistente a los tratamientos ensayados .
DISCUSIÓN
La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, causada por el protozoario flagelado T. cruzi, constituye un importante problema de salud pública en América Latina que afecta anualmente a millones de personas.37 El tratamiento más común para el control de la enfermedad es el uso de las drogas nifurtimox y benznidazol; sin embargo, el tratamiento genera diversos efectos colaterales adversos y baja eficacia clínica en dependencia del genotipo del parásito.10,11,38 Es por ello la necesidad de buscar alternativas en el tratamiento de la enfermedad con el uso de plantas medicinales, muchas de estas utilizadas en la medicina tradicional.
Una familia vegetal importante de amplia ocurrencia en especies en América Tropical es la Piperaceae en que varias especies de Piper han mostrado actividad biológica contra plagas y enfermedades; se destacan entre estas P. solmsianum, un arbusto de 1-3 m de altura, comúnmente establecido en el sudeste del Brasil, cuyos estudios fitoquímicos revelaron la presencia de monoterpenos, sesquiterpenos, arilpropanoides, fenilpropanoides, lignanos y neolignanos, con actividad biológica contra bacterias, hongos y la forma tripomastigota de T. cruzi.39
En algunos estudios se ensayaron extractos crudos y en otros casos sustancias puras. Precisamente, en P. solmsianum se evaluaron los lignanos tetrahidrofuranos grandisina (a), rel -(7R,8R,7´R,8´R)-3´,4´-metilendioxi-3,4,5,5´-tetrametoxi-7,7´-epoxilignana (b) y rel- (7R,8R,7´R,8´R)-3,4,3´,4´-dimetilendioxi-5,5´-dimetoxi-7,7´-epoxilignana (c). Estos últimos químicamente muy similares, aislados de inflorescencias y ensayados sobre formas tripomastigota de T. cruzi (cepa Y) en las concentraciones de 5, 25 y 50 µg/mL; se ha observado una mayor actividad tripanocida en la sustancia (a) que alcanza 92,8 % de inhibición en el crecimiento en la concentración de 50 µg/mL.21 En P. regnellii, extracto hidroalcohólico etanol:agua (90:10) de hoja, en 100 µg/mL de concentración se observó una inhibición en el crecimiento de la forma epimastigota de T. cruzi de 89,7 %;23 de manera que resulta posible que la actividad biológica de P. regnellii se deba a la presencia del neolignano eupomatenoide-7 y el lignano fragransina E1, aislados de Aristolochia taliscana y que inmovilizaron formas epimastigota de T. cruzi.40 En P. arboreum y P. tuberculatum las fracciones hexánicas de hojas, ensayadas sobre formas epimastigota cepa Y de T. cruzi, presentaron mayor efecto inhibitorio, mientras que las fracciones hexánicas de frutos presentaron menor efecto inhibitorio; la actividad biocida se le atribuyó a las amidas, piperilina y 4,5-dihidropiperilina.26
Por otro lado, las amidas naturales piperovatina y piperlonguminina, aisladas de P. ovatum, resultaron activas sobre la forma epimastigota de T. cruzi; se observaron alteraciones en la membrana plasmática y mitocondria, y se asumió que las disfunciones mitocondriales inducidas por las amidas conllevan a alteraciones bioquímicas que conducen a la muerte de las células.32 Igualmente, en otro estudio realizado en ratones, se evaluó las propiedades terapéuticas in vivo de (-)-cubebina (50 mg/kg), un compuesto aislado de semillas secas de P. cubeba L. y (-)-hinokina (20 mg/kg), preparado por oxidación de (-)-cubebina; se observaron diferencias en el núcleo de las células del bazo de ratones no infectados, infectados tratados e infectados no tratados, de manera que resultó el perímetro del núcleo mayor en animales infectados no tratados, sin evidenciar toxicidad.33
En general, los resultados de la actividad tripanocida de extractos crudos y sustancias puras de varias especies de Piper fueron inferiores frente a los del presente trabajo, como fue el caso de P. regnellii en que los resultados fueron iguales que los de extractos de plantas in vitro (10-12 meses) (89,7 %) e inferioesr que los de extractos de tallos (96,09 %) de P. solmsianum, pero en ambos casos con extractos de 50 µg/mL de concentración e incluso con extractos de tallos de 25 µg/mL en que se alcanzó hasta 92,49 % de inhibición en el crecimiento; asimismo, respecto a P. arboreum y P. tuberculatum en que los valores de CI 50 presentaron menor efecto inhibitorio respecto a los valores de P. solmsianum, en el presente trabajo.
En otros estudios realizados en 311 especies evaluadas procedentes de varias regiones de América Central y Sudamérica, solamente 17 especies (5,4 %) mostraron actividad antiparasitaria sobre Plasmodium falciparum, Leishmania mexicana y T. cruzi con CI50≤ 10 µg/mL; la mayor actividad sobre T. cruzi correspondió al extracto etanólico de tallos de Bourreria huanita (Boraginaceae).41 Igualmente, en otro estudio similar realizado en Brasil con 92 extractos etanólicos obtenidos de diferentes partes de plantas de numerosas familias de la Mata Atlántica y el Cerrado de São Paulo, sobre la forma epimastigota Y y cepas de Bolivia de T. cruzi, se observó que la mayor actividad tripanocida se alcanzó con extractos de frutos de Ocotea paranapiacabensis y Aegiphila lhotzkiana.42 También, extractos de diclorometano o metanol agua (4:1) de 31 especies de la región central de Chile se evaluaron sobre formas tripomastigota de T. cruzi; la mayor actividad tripanocida se observó con los extractos de Podanthus ovalifolius, Berberis microphylla, Kageneckia oblonga y Drymis winteri, y se atribuyó la actividad biológica, en el caso de D. winteri, a los sesquiterpenos drimanos: poligodial, drimenol e isodrimenina.43
En otro estudio, extractos etanólicos de Senna villosa (Fabaceae), Serjania yucatenensis (Sapindaceae), Byrsonima bucidaefolia (Malpighiaceae) y Bourreria pulchra (Boraginaceae), fueron evaluados sobre formas epimastigota y triopomastigota de T. cruzi, y se observó que los extractos de hojas de S. yucatenensis y B. pulchra fueron más activos sobre epimastigota y tripimastigota; asimismo, solamente el extracto de hoja de S. yucatenensis mostró significativa actividad tripanocida en ensayos in vivo, y redujo en 75 % la parasitemia en ratones infectados.44 Al igual que en los estudios anteriores, estos valores, sean expresados en porcentaje de inhibición o como CI50, resultaron similares o inferiores a los mostrados en el estudio realizado en nuestro trabajo con P. solmsianum.
Aunque los extractos de plantas in vitro de P. solmsianum mostraron un ligero menor efecto inhibitorio en el crecimiento de T. cruzi, respecto a los extractos de plantas silvestres maduras y la grandisina, este fue ligeramente menor en la forma epimastigota, la que en general mostró mayor susceptibilidad que la forma tripomastigota; no se observaron diferencias significativas entre las plantas in vitro de 6-8 meses respecto a las plantas in vitro de 10-12 meses. La fuerte actividad tripanocida de las plantas in vitro abre la posibilidad de biosintetizar los compuestos activos en gran escala con el establecimiento de suspensiones celulares.45,46 Las mayores ventajas del sistema de cultivo de células sobre los métodos convencionales de propagación de plantas completas, estriban en que los compuestos útiles pueden ser producidos bajo condiciones controladas independientemente de los cambios climáticos o condiciones del suelo; los cultivos pueden establecerse libres de microorganismos y plagas; las células pueden multiplicarse para producir metabolitos específicos; y el control automatizado del crecimiento celular y la regulación racional de los procesos metabólicos pueden reducir significativamente los costos y mejorar la productividad.47
Por otro lado, el uso de sustancias puras no siempre resulta más efectivo que los extractos crudos. Al respecto, se ha señalado que el uso de extractos crudos tiene una profunda significación y ventaja ecológica puesto que por ser fuente de una complejidad de moléculas muestra diversas bioactividades, lo que eleva los niveles de toxicidad en relación con los compuestos individuales químicamente puros, a lo que se suma el riesgo de inducir resistencia.48 Adicionalmente, se ha propuesto como estrategia de trabajo el uso de extractos heterogéneos de toda la biomasa de la planta, para inducir un efecto sinergístico sobre algún organismo específico.49 Es el caso que en el control del IV estadio larval de Anticarsia gemmatalis, se reportó que los extractos crudos de semillas, hojas y tallos causaron 80 % de mortalidad con 800 µg/insecto y las amidas pillitorina y 4,5-dihidropiperlonguminina causaron 100 % de mortalidad con 200 y 700 µg/insecto,50 lo que de alguna manera confirmó la importancia de utilizar extractos crudos. Recientemente, en Croton cajucara el extracto metanólico de tallo leñoso fue más activo que los compuestos aislados trans-dehidrocrotonina y ácido acetil aleuritólico sobre la forma tripomastigota de T. cruzi.51 En nuestro estudio sobre la actividad tripanocida de P. solmsianum sobre las formas epimastigota y tripomastigota de T. cruzi, varios extractos crudos de plantas in vitro y plantas silvestres resultaron superiores a la sustancia pura grandisina.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.
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Recibido: 15 de
agosto de 2016.
Aprobado:
25 de noviembre de 2016.
Guillermo E. Delgado-Paredes. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Ciudad Universitaria, Juan XXIII 391. Lambayeque, Perú. Correo electrónico: guidelg2015@yahoo.es
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