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Detección de beta exotoxinas en aislamientos de Bacillus thuringiensis nativos de Cuba
Detection of beta-exotoxins in isolates of Bacillus thuringiensis native to Cuba
Aileen González Rizo,I Zulema Menéndez Díaz,I Israel García García,I Jorge Anaya Martínez,I Raúl González Broche,I Irma R Calderón Camacho,I Yamilé Baró Robaina,II Ariamys Companioni Ibañez,I René Gato ArmasI
I Departamento de Control
de Vectores. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”.
IPK. La Habana, Cuba.
II Instituto de Investigaciones de
Sanidad Vegetal, INISAV. La Habana, Cuba.
RESUMEN
Introducción: Bacillus
thuringiensis es una bacteria Gram positiva esporulada, conocida principalmente
por su patogenicidad contra insectos. Algunas cepas sintetizan metabólitos
secundarios termoestables análogos de nucleosidos identificados como beta
exotoxinas. La organización Mundial de la Salud ha recomendado que no se
utilicen cepas de Bacillus thuringiensis productoras de beta exotoxinas
para el control de insectos por su inespecífico rango de acción y
su toxicidad contra células de mamíferos.
Objetivo: detectar mediante bioensayos la presencia de beta exotoxinas
en aislamientos cubanos de Bacillus thuringiensis con actividad entomopatógena
contra Aedes aegypti (Linneaus, 1762).
Métodos: se colocaron huevos de Aedes aegypti en 500mL
de agua a 37 °C hasta su eclosión, se añadió 66 mg de harina
de pescado en 10 mL del sobrenadante del cultivo autoclaveado. Diariamente se
contaron los individuos vivos hasta los 7 días. Los datos de mortalidad
fueron procesados estadísticamente mediante el análisis de la varianza
de una vía (ANOVA) y comparación múltiple de Tukey. Las diferencias
fueron consideradas estadísticamente significativas para p< 0,05. Se
corroboró la presencia de beta exotoxinas de manera directa mediante espectofotometría.
Resultados: se detectó la presencia de beta exotoxinas por
los dos métodos aplicados en un solo aislamiento (A51).
Conclusiones: la ausencia de beta exotoxinas en 11 aislamientos
con marcada actividad entomopatógena contra Aedes aegypti ratifica
su potencialidad para el desarrollo de nuevos biolarvicidas.
Palabras clave: Bacillus thuringiensis; beta exotoxinas; toxinas bacterianas; bioensayos; Aedes aegypti.
ABSTRACT
Introduction: Bacillus
thuringiensis is a sporulated gram-positive bacterium, well known mainly
for its pathogenic action against insects. Some strains synthesize thermostable
nucleoside analog secondary metabolites identified as beta-exotoxins. The World
Health Organization has recommended that beta-exotoxin-producing Bacillus
thuringiensis strains not be used for insect control, due to their unspecific
range of action and their toxicity to mammalian cells.
Objective: detect by means of bioassays the presence of beta-exotoxins
in Cuban isolates of Bacillus thuringiensis with entomopathogenic activity
against Aedes aegypti (Linneaus, 1762).
Methods: aedes aegypti eggs were put in 500 mL water at 37 °C
until eclosion. Next, 66 mg fish flour were added to 10 mL of the supernatant
of the autoclaved culture. Living individuals were counted daily for 7 days.
Statistical processing of mortality data was conducted with one-way analysis
of variance (ANOVA) and Tukey's multiple comparison. The differences found were
considered to be statistically significant for p< 0.05. The presence of beta-exotoxins
was directly confirmed by spectrophotometry.
Results: the presence of beta-exotoxins was detected by the two methods
applied in only one isolate (A51).
Conclusions: absence of beta-exotoxins in 11 isolates with marked entomopathogenic
activity against Aedes aegypti confirms their potential for the development
of new biolarvicides.
Key words: Bacillus thuringiensis;
beta-exotoxins; bacterial toxins; bioassays; Aedes aegypti.
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades trasmitidas por vectores constituyen un grave problema a nivel mundial. La disminución de su impacto en la sociedad depende de las intervenciones que se lleven a cabo para el control de los vectores.1 Formulaciones en base a Bacillus thuringiensis son ampliamente utilizadas a escala mundial para el control larvario de dípteros de importancia médica.2 Esta bacteria Gram positiva esporulada, produce diversas toxinas patógenas contra insectos. Se destacan las Cry y Cyt que son sintetizadas durante la fase de esporulación y muestran toxicidad selectiva a nivel del orden de insectos. Sin embargo, durante el crecimiento vegetativo algunas cepas secretan al medio metabólitos secundarios, termoestables análogos de nucleosidos con amplio rango de acción, identificados como beta exotoxinas.3,4 En 1959 se detectó actividad tóxica contra gran número de especies de insectos de los sobrenadantes autoclaveados de cultivos de Bacillus thuringiensis.4 La organización Mundial de la Salud (OMS) ha recomendado que no se utilicen cepas de Bacillus thuringiensis productoras de beta exotoxinas para el control de insectos, o al menos que los productos comerciales se encuentren libres de ellas.4,5
Se han descrito varios métodos para la detección de beta exotoxinas pero los fundamentales son la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, siglas en ingles) y los bioensayos con larvas de Musca domestica.6-8
El laboratorio de control biológico del Instituto “Pedro Kourí” (IPK), La Habana, Cuba, cuenta con numerosos aislamientos autóctonos con elevada actividad entomopatógena contra dípteros de importancia médica.9,10 El desarrollo de nuevos biolarvicidas a partir de ellos depende, en gran medida, de que carezcan de capacidad para sintetizar beta exotoxinas. Por lo que en este estudio nos propusimos detectar mediante bioensayos la presencia de beta exotoxinas en aislamientos cubanos de Bacillus thuringiensis con actividad entomopatógena contra Aedes aegypti (Linneaus, 1762).
Para lo cual se diseñó un protocolo que incluyó la centrifugación para eliminar las células, esporas y cristales de los cultivos y se autoclavearon para eliminar otros factores de virulencia asumiendo que las beta exotoxinas son termoestables. Con el producto final se realizó un bioensayo para determinar el efecto sobre Aedes aegypti.
Bacillus thuringiensis: HD-1 y NRD-12, controles negativo y positivo de producción de beta exotoxinas, respectivamente (suministradas por el Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal INISAV, La Habana, Cuba). IPS-82 (estándar Internacional, Instituto Pasteur, Paris, Francia, Bacillus thuringiensis serotipo H-14).
Aislamientos nativos: A21, A51, C17, L95, L910, M29, R84, R85, R87, R89, U81, X48 pertenecientes a la colección del laboratorio control biológico del IPK.
Aedes aegypti: Cepas Rockefeller, suministrada por el CDC de San Juan, Puerto Rico
Tanto las cepas controles como los aislamientos nativos fueron reactivadas en
caldo nutriente PH 7,0 por 24 h a 37 °C agitación orbital a 150 rpm.
Se transfirió 2 mL del inóculo a Erlenmeyers con 200 mL de caldo nutriente
suplementado con sales inorgánicas (MgSO4 12,5 mM; MnSO4
0,05 mM; FeSO4 1,2 mM; ZnSO4 1,2 mM; CaCl2
25 mM) y se incubaron 72 h en agitación orbital a 150 rpm 30 °C. Se
centrifugó 25 mL de este cultivo a 3000 rpm 4 °C, hasta lograr una
completa clarificación. El precipitado se descartó y el sobrenadante
se autoclaveó a 121 °C por 20 min y conservó a -20 °C.
Se colocó 100 huevos de Aedes aegypti (cepa Rockefeller) en 500mL de agua a 37 °C y se verificó la eclosión a las 4 h. Se añadió 66 mg de harina de pescado como alimento, suspendidos en 10 mL del sobrenadante del cultivo autoclaveado. El procedimiento se repitió durante 5 días consecutivos. Las larvas fueron introducidas en jaulas cuando alcanzaron el IV estadio. Diariamente se contaron los individuos vivos según el desarrollo y se concluyó el experimento a los siete días. Los bioensayos se repitieron cuatro veces en semanas diferentes. Se calculó las medias de mortalidad y se compararon estadísticamente mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA). Las diferencias entre los grupos fueron analizadas mediante la prueba de Tukey, considerando una p< 0,05.
Se determinaron los espectros de absorción de los cultivos clarificados y autoclaveados para corroborar la presencia de beta exotoxinas, siguiendo el procedimiento descrito por Galán y col 1994.11
La cepa NRD-12 y el aislamiento nativo A51 exhibieron una elevada toxicidad (73,95 % y 65,5 % de mortalidad respectivamente) contra Aedes aegypti, (tabla), lo cual resultó estadísticamente significativo con respecto al control negativo y el resto de los aislamientos (ANOVA, F= 49,96 p˂ 0,05).
En la figura se muestran los espectros de absorción
para los sobrenadantes de los aislamientos que ocasionaron más de un 10
% de mortalidad y los controles utilizados en el estudio. Al comparar los espectros
de absorción se pudo determinar que solamente un aislamiento nativo con
toxicidad presentó picos cercanos a los del control positivo para esta
toxina, lo que ratifica los resultados obtenidos en los bioensayos.
Aunque análisis mediante HPLC es más rápido y presumiblemente
más reproducible,6,12 no evidencia la acción directa de
las beta exotoxinas sobre los insectos,13 además de ser necesario contar
con un patrón puro de beta exotoxina para el análisis y de un equipamiento
que no se encuentra presente en muchos laboratorios. Por lo que tradicionalmente
se utilizan los bioensayos como método de referencia para detectar beta
exotoxinas en las cepas de Bacillus thuringiensis.8,14-17
En este trabajo se pudo determinar la ausencia de beta exotoxinas en 11 aislamientos con marcada actividad entomopatógena contra este vector, lo que permite ratificar su potencialidad para el desarrollo de biolarvicidas.
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Recibido: 2 de diciembre de 2015
Aprobado: 26 de febrero de 2016
Aileen González Rizo.
Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" Ave. Novia del Mediodía,
Km 6 ½, La Lisa, La Habana, La Habana, Cuba.
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